鉴于二氧化碳培养箱在使用过程中会伴随着微生物滋生，为确保培养箱免受污染，细胞能拥有安全的生长环境，出现了各种灭菌方法：如紫外灭菌消毒、HEPA过滤除菌、液体消毒剂及加热灭菌等。

1紫外灭菌消毒
难以清除二氧化碳培养箱风道等避光处污染，且紫外灯光线会随时间而衰减，灭菌效果较差。

2HEPA过滤器除菌
内部增加HEPA滤膜，箱内不锈钢内胆光滑表面等都具有污染物防护作用。

3二氧化碳培养箱液体消毒剂
简易的消毒方法，有一定的效果但不能保证*灭菌。
相较而言，加热灭菌方式是比较有效的方法，分为湿热灭菌和干热灭菌两种，目前市面上常见的是90度湿热灭菌和140度干热灭菌两种。

4二氧化碳培养箱湿热灭菌

湿热灭菌指温度超过100℃后水转变为水蒸汽并产生高压强，对微生物进行高压及穿透性导热灭菌，而培养箱使用90℃湿热灭菌通常无法达到理想的灭菌效果。

5二氧化碳培养箱干热灭菌
干热灭菌是通过高温使蛋白质及核酸变性失活，达到杀灭的目的，但干热140度仍会存在灭菌不*的情况，部分芽孢和孢子可能无法灭活。